罗执芬,周云 ,刘明月
河南省人民医院肿瘤科郑州市450003
【摘要】 目的 探讨羟基喜树碱诱导胃癌细胞凋亡与细胞周期变化的关系。方法 用MTT法测定不同浓度的HCPT对胃癌细胞的生长抑制作用,用流式细胞仪测定一定浓度下不同作用时间细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果 在3.125~5O.O g/ml浓度范围内药物对细胞的抑制率随浓度的增加而增加;在相同浓度下,随时间的延长细胞的凋亡率也逐渐增加,0、12、24、48h的凋亡率为2、8% 、8.5% 、10.2% ,13.3% ,在24h内S期细胞减少而Gn/G 细胞增多,第二个24h S期和G /M的阻滞。结论 羟基喜树碱可诱导胃癌细胞凋亡,其细胞凋亡与细胞周期分布有关。
关键词 羟基喜树碱;胃癌;细胞凋亡
羟基喜树碱是从我国特有的珙桐科植物喜树中提取分离的天然生物碱,是一类广谱的抗肿瘤药,尤其在消化道肿瘤中的应用更多。近年来不少研究人员对羟基喜树碱诱导不同肿瘤细胞的凋亡进行了大量的研究,细胞周期与凋亡有着密切的关系,为了探讨羟基喜树碱诱导的细胞凋亡与细胞周期的关系,为临床设计更有效的治疗方案提供实验室依据,特设计此实验。
1 材料与方法
1.1 材料 ①细胞株:人胃癌细胞BGC一823,河南省医学研究所惠赠。② 实验用药物及试剂:羟基喜树碱为湖北黄石飞云药业产品;1640培养基为GIBCO公司产品;四甲基偶氮唑蓝(MTY)为Sigma公司产品;标准胎牛血清为天津TBD血液研究所产品。
1.2 方法 ①MrlT法测定不同浓度羟基喜树碱对细胞生长的抑制率。实验药物浓度按预实验结果选五个浓度组即0、3.125、6.250、12.500、25.000、50.O00gg/ml。取对数生长期的细胞稀释成4×10 /ml,接种于96孔板,孵育24 h,按实验设计加入实验用药,设实验组和对照组,每组设4个复孔,放人培养箱中孵育48 h,用酶联免疫检测仪在570 am波长测每孔的吸光值(A),按下列公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率(%)=(1一实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。每组重复5次。②细胞凋亡率和细胞周期检测:本次取6.2501xg/ml组作流式细胞仪检测,取4个时间段,即药物作用后0、12、24、48 h进行检测。按实验设计处理细胞后,用70% 的冷乙醇固定。采用碘化丙锭(PI)一步插人性DNA定量荧光染色法,检测细胞周期和细胞凋亡率。
1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件包处理。计量资料采用正态性检验,方差齐性检验,率的比较采用x 检验,以 =0.05为检验水准。
2 结果
本实验中HCPT单药对BGC一823细胞有明显的抑制生长的作用(见图1),其IC50为27.420~g/ml。相关性分析结果相关系数r为0.986。在流式细胞图上可看到典型的亚二倍体凋亡峰(见图2),细胞周期分布显示(见表1),24h内S期细胞随时间延长而减少,G。/G。期细胞渐增多,凋亡率也增加。与0h相比有统计学差异。
3 讨论
本组实验表明羟基喜树碱可以诱导胃癌BGC一823细胞的凋亡,其凋亡率有时问依赖性,其与细胞周期的变化有一定的相关性。在0h S期细胞所占的比率较大,加入药物后的第一个24h,细胞中S期细胞的比率明显下降,而G 期的细胞增多。在第二个24h S期细胞明显增多,与0h比较有统计学意义。说明羟基喜树碱诱导凋亡的机制可能与G.期和S期细胞的阻滞有关。许青在胃癌细胞,肺癌细胞上研究了羟基喜树碱诱导凋亡的机制,揭示了诱导凋亡是其抗肿瘤作用的主要机制之一。Chai LP 用低剂量的HCPT作用于喉鳞癌细胞,表现出G /M的阻滞,高剂量时表现出s期细胞的阻滞。而本试验低剂量时表现出第一个24h G。阻滞和第二个24h的S和G /M期的阻滞,这一特点与喜树碱的半合成品伊立替康作用于结肠癌细胞HT一29对细胞周期的分布影响有相似之处 J。细胞凋亡存在着周期特异性,表现为不同的因素诱导的凋亡,发生在细胞的不同周期时段。进一步地研究HCPT对细胞周期的分布特点,将为不同药物联合使用提供实验室依据。
参考文献(略)